组织学技术的基本理论和技术

组织学技术的基本理论和技术

2019-10-08 20:04

  组织学技术的基本理论和技术_冶金/矿山/地质_工程科技_专业资料。组织学技术的基本理论和技术 组织制片分类 一、超活体染色制片二、活体染色制片三、分离制片法四、涂片法五、印片法六、整装片 七、磨片法八、切片法九、血管注射法十、整装切片法 组织制片技术及其神经组织的制

  组织学技术的基本理论和技术 组织制片分类 一、超活体染色制片二、活体染色制片三、分离制片法四、涂片法五、印片法六、整装片 七、磨片法八、切片法九、血管注射法十、整装切片法 组织制片技术及其神经组织的制片技术 一、动物麻醉法 1.吸入麻醉法 2.戊巴比妥钠或乌拉坦注射麻醉法 3.空气栓塞 4.直接杀 死法 二、动物取材(一)动物选择(二)组织取材的方法 神经系统的取材 1.脊髓 2.神经纤维 3.大脑和小脑 三、固定和固定液 (一)固定的目的和意义: 目的: 1、 能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。 2、保存细胞固有的物质,能凝固或沉淀细胞内或组织液,糖原等,使细胞或组织基本上保 持与生活时的物质一样。 3、 使组织硬化,便于切块。 4、 对某些具有传染性的标本,能防止疾病的扩散。 5、 保存好大体标本。 6、 可增强染色的作用 意义: 组织经一系列的处理后, 就必须进行固定, 当然有的组织是先固定, 再进行处理, 然后再固定。固定的作用,从组织学的角度其简单的定义是,保持细胞、组织的固有形态 和结构,使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构,而从免疫组化技术的角度,固定的 作用不仅是使细胞内蛋白质凝固,尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应;防止细胞 的自溶,以免使抗原扩散至组织间质;以保持组织的固有形态和结构;更重要的是保持组 织或细胞的抗原性,不但要使抗原不导致失活,而且不使抗原发生弥散的现象,才能在免 疫组化染色时,不产生过深的背景,影响对阳性物的判断。 (二)固定的方法 1.小块组织固定法 2.局部组织固定法 3.整体注射固定法 4.蒸汽固定法 三、固定和固定液 (三)组织固定与温度的关系 Bernard 经过一系列的研究后认为,肝、肾、肺的最佳固定温度是 70℃,和 77℃,因为各 种组织的结构不同,成分不一,电子密度不一样,因而固定所需要的温度也不样。我们的 实验认为, 65℃左右的温度可适合于各种组织, 条件是固定取小块材料, 时间在截取 3-4min。 (四)固定应注意的问题 1、 组织固定越新鲜越好。 2、 组织固定,组织块不宜过大。 3、 对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。 4、 组织固定,时间不宜太短,也不宜太长。 5、 固定液的量要充分。 6、 特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。 7、 组织的第二次固定或后固定。 (五)固定液: 固定液必须具备的性能:固定液必需要有较强的渗透能力,能迅速地渗 入组织内部,不会使组织过度收缩或膨胀,并且能使组织内易观察的成分可以凝固为不溶 性物质,能使组织达到一定的硬度,获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲和力。 固定液的分类 单纯固定剂 1.福尔马林 2.乙醇 3.丙酮 4.氯化汞 5.重铬酸钾 6.铬酸 7.苦味酸 8.锇酸 9.醋酸 10.三氯醋酸 固定液的分类 混合固定剂 1.甲醛混合固定液 2.酒精混合固定液 3.丙酮混合固定液 4.氯化汞混合固定液 5.重铬酸钾混合 固定液 6.铬酸混合固定液 7.锇酸混合固定液 8.苦味酸混合固定液 9.三氯醋酸混合固定液 四、组织冲洗、脱水与透明 (一)组织冲洗 1.简易流水冲洗法 2.一列式玻瓶或水槽冲洗法 3.倒置冲洗法 4.酒精洗涤法 组织与酒精 1:20 12~24 小时 50%~70%酒精,更换 3~6 次,每 4 小时更换 一次,可在 70%酒精中较长时间保存 (二) 组织脱水 1.脱水剂 乙醇 丙酮 正丁醇 二氧氯环 2.脱水方法 (三)组织透明 1.二甲苯 2.甲苯 3.苯 4.香柏油 5.三氯甲烷(氯仿)6.安妮林油 五、组织浸蜡与包埋 (一)浸蜡 软蜡:熔点:45~54℃ 硬蜡:熔点:56~ 58℃ ,60~62℃(包埋) (二)包埋 1.石蜡包埋操作过程 制作石蜡切片,切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡 中,而水与石蜡又是不相混合的,所以在浸蜡,包埋前必须将组织内所含的水分脱去。而 大多数的组织固定剂是水溶液,随后的水冲洗也使其含有大量水分,因此必须先行脱水, 一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。由于酒精和石蜡不能混合,须再用一种石蜡的溶 剂来置换酒精,因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状,所以 此步骤又称透明。最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。 常规的石蜡包埋过程包括五 个基本步骤,即固定,脱水,透明,浸蜡和包埋。 2.石蜡包埋注意事项 1.作为包埋组织使用的石蜡不仅由于气候的不同需要加以选择, 而且与组织的硬度也有密切 关系,过硬的组织最好用硬度较高的石蜡包埋,反之,软组织则应以硬度较低的石蜡包埋。 其熔点一般要求再 60C 左右。 2.包埋用石蜡加温不可过高,以保持其不凝固为度,温度过高容易将组织烫坏,使得组织变 硬,变脆,并发生卷曲,收缩变形而不利于切片,甚至影响诊断。 另外注意埋蜡的温度和组织本身的温度,两者是否合适,温度不一致常可造成组织与周围 石蜡脱裂的现象,而达不到包埋的作用。 3.包埋用石蜡应掌握用量,以组织全部包埋完毕,石蜡也恰好用完为宜。 4.包埋应注意组织病变面放在下面,并尽可能使组织放平,在不损伤组织的情况下可用镊子 轻压。 5.囊壁和消化道等组织包埋时更应注意组织方位,应将组织块直立拉平,不要卷曲。 6.相同组织如包埋于一个蜡块时,除包平外,还要注意方向的一致,以利切片。 7.多块组织和碎组织包埋于一个蜡块内时,组织的排列一定要密挤靠拢,以求成直线或方块 行,这样有利于切片。 8.石蜡包埋后,不宜冷凝过慢,特别是室温较高时,石蜡凝固后应立即投入冷水中加速冷却 可增加石蜡密度,韧性和硬度。但冷凝过速也会因为内外温差过大造成蜡块裂损。 六、组织切片 1.石蜡切片法 2.火棉胶切片法 3.冰冻切片法 七、染料与染色 (一)染色简史 (二)染料分类 1.天然染料 苏木精 胭脂红(卡红) 地衣红 2.人工合成染料 八、常规染色技术 H-E 染色的步骤和方法 常规 HE 染色步骤 (1) 二甲苯 (Ⅰ) 5-10 min (2) 二甲苯 (Ⅱ) 5-10 min (3) 95%乙醇(Ⅰ) 1-3 min(4)95%乙醇(Ⅱ) 1-3 min (5)80%乙醇 1 min(6)蒸馏水 1 min (7)苏木精液染色 5-15 min (8 ) 流水稍洗去苏木精液 1-3 s (9) 1%盐酸乙醇 1-3 s (10) 稍水洗 10-30 s (11)促蓝液返蓝 10-30 s (12) 流水冲洗 10-15 min (13)蒸馏水过洗 1-2 s (14) 0.5%曙红液染色 1-3 min (15) 蒸馏水稍洗 1-2 s (16) 80%乙醇稍洗 1-2 s (17) 95%乙醇(Ⅰ) 2-3 s (18) 95%乙醇(Ⅱ) 3-5 s (19) 无水乙醇 5-10 min (20) 石炭酸二甲苯 5-10 min (21) 二甲苯(Ⅰ) 2 min (22) 二甲苯(Ⅱ) 2 min (23) 二甲苯(Ⅲ) 2 min (24) 中性树胶封固 注:①第(10) 、 (11)步可省去, (12)步冲水时间需延长至 20-30min。 ②第(20)步如果不用石炭酸二甲苯,可改用无水乙醇。 冷冻切片 HE 染色步骤: (1)冰冻切片固定 10~30 s (2)稍水洗 1~2 s(3)苏木精液染色(60℃) 30~60 s (4)流水洗去苏木精液 5~10 s(5)1%盐酸乙醇 1~3 s (6)稍水洗 1~2 s(7)促蓝液返蓝 5~10 s (8)流水冲洗 15~30 s(9)0.5%曙红液染色 30~60 s (10)蒸馏水稍洗 1~2 s(11)80%乙醇 1~2 s H-E 染色应注意的问题 (1)取材,提前配好各种固定液,并备有大量原液备用,取材后立即整修组织块,换固定液后继 续固定。 (2) 取消化管时应注意的问题:因为消化管的粘膜上皮容易破坏和自溶,以往取材多为小片 块,而且在外力(手压、刀切)作用下易造成粘膜损坏和肌层收缩.因此我们采用取大片及长段 组织固定,将剖开的消化管贴在滤纸上 .因消化管管壁薄 ,大片及长段固定不影响固定液的渗 透,固定效果理想,然后再取未受损部位组织脱水,包埋,保存。 (3) 消化管部位以空腹取材最为理想,尽量避免冲洗,特别是胃的壁细胞在空腹时胞质着色 非常鲜亮。 (4)载玻片和盖玻片的处理:载玻片最好在无水乙醇中浸泡 12~24hr,以达到彻底脱脂的目 的,用前再用的确良白布擦净;盖玻片必须在清洗液中浸泡 24hr 后清水冲洗,浸无水乙醇数小 时后用尼龙绸布擦净。 (5) 伊红染液的浓度:以往常用 0.5%~1%的伊红染液,此浓度脱色时间长,可以采用 95%乙 醇 450ml+1%复制伊红乙醇溶液 50ml 的稀释液染色。 (6)封片:将切片从二甲苯中取出后,用尼龙绸布将组织周围的二甲苯擦净,组织片避免干燥, 滴少许中性树胶,将盖片在酒精灯上烤一下,以达到蒸发空气中水份及将盖片上肉眼不易观 察到的污物烧掉,并有利于中性树胶的均匀扩散。 (7)磨刀:在自动磨刀机上加机油磨刀,磨后擦净刀上的污垢即可切片.免去鐾刀这一工序 , 因经过鐾刀皮鐾刀有时使刀口损坏,(鐾刀皮用时间长后,刀皮二边上翅或鐾刀角度稍有不当, 用力不匀等均能造成刀口损坏)。 细胞与组织的特殊染色技术 概述 细胞学特染技术 神经节神经细胞内高尔基复合体的显示 1.Da-Fano 氏高尔基复合体显示法 2.Mcdonald 氏高尔基复合体改良法 3.Cajal 硝酸铀高尔基复合体显示法 4.高尔基复合体 Elftman 氏直接浸银法 5.高尔基复合体锇酸浸染法 神经组织 一、神经组织的取材和固定二、常用染色法三、神经组织染色注意事项 神经细胞(一)神经细胞分离标本 牛脊髓神经细胞分离卡红染色法(二)大、小脑神经细 胞及其突起的染色 Cox 氏法(三)小脑篮状细胞 Kopsch 氏改良 Golgi 氏法 (四)假单极 神经元 Ranson 氏吡啶银法(五)双极神经元 De Castro 氏法 神经细胞(六)多极神经元 Ranson 氏吡啶银法 肠壁肌间神经丛的显示(七)尼氏体 尼 氏体天竺牡丹染色法 尼氏体天青Ⅱ-焦油紫染 (八)高尔基复合体 高尔基复合体的显 示法(九)攀缘纤维 Ranson 氏吡啶银法(十)神经原纤维 Cajal 氏法 突触 改良的 Cajal 氏法 神经纤维 1.郎飞氏结 郎飞氏结石蜡切片法 郎飞氏结分离制片法 2.神经纤维髓鞘漏斗膜 Cajal 氏硝酸铀法 3.神经角质网的显示 Hansen 氏铁苏木精染色法 神经末梢 Gross-Schultze 氏改良 Bielschowsky 氏法 Faworsky 氏法对肌梭的显示 改良的 Bielschowsky 氏法对整装片环层小体的显示 Lowit 氏氯化金-甲酸法显示运动终板 内脏神经末梢美兰超活体染色法 髓鞘(一)正常髓 Weigert 氏苏木精染色法 髓鞘四氧化锇染色法(二)变性髓鞘 Swank-Davenport 改良 March 氏法染变性髓鞘 Weigert-pal 氏髓鞘染色 神经胶质细胞 1.纤维性星形胶质细胞 Cajal 氏金升汞法 2.原浆性星形胶质细胞 Kopsch 氏改良 Golgi 氏法 3.小胶质细胞 改良的 Penfield 氏法 4.少突胶质细胞 Grino 氏法 神经组织特殊染色技术 一、Golgi 氏神经细胞及突起镀银法二、Golgi’s-Cox 法三、Cagal 氏神经原纤维镀银法四、 Cajal 六法突触显示法五、Golgi-Jen 氏突触镀银法六、Cajal 吡啶银法(一)七、Cajal 吡 啶银法(二)神经组织特殊染色技术八、Nissl body C.V.T.M.T.合并染色法九、Nissl body 石碳酸复红染色法十、 比萨斯克氏神经组织染色法十一、 神经胶质细胞 Cajal 氏镀银法十二、 少突胶质细胞和小胶质细胞 Grino 改良法 十三、 Del Rio-Hortega 氏小胶质细胞和少突胶质 细胞镀银法神经组织特殊染色技术十四、神经胶质细胞 Penfield 改良法十五、大脑皮质细 胞分层及神经胶质细胞 石蜡切片镀银法十六、少突胶质细胞和小胶质细胞 Marchall 法十 七、Ranson 氏游离神经末梢染色十八、运动终板、肌梭及腱梭镀金技术 神经髓鞘染色技术十九、Luxol 快兰-焦油紫正常髓鞘及 尼氏体染色法(Kluver 氏)二十、 Weil 髓鞘染色法二十一、髓鞘(Osmic Acid)染色法二十二、Spielmeyer’s 髓鞘冰冻切片 染色法二十三、weigert’s 神经髓鞘染色法神经髓鞘染色技术二十四、变性髓鞘 Nauta 和 Gygax 染色法二十五、Fink Heimer 变性髓鞘染色法二十六、变性髓鞘新镀银方法(日本 1975)二十七、Bielschowsky-Gros 肠肌神经丛镀银技术二十八、中枢神经系统神经终足铬 -银浸染技术二十九、乙酰胆碱酯酶与硝酸银混合法显示肌肉中神经轴突及运动终板 _www.785678.com彩霸单双四肖

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